谷*酰胺（Gln）含量檢測試劑盒

微量法

貨號：BC5305

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 提取液二：氯仿，需自備。

2. 試劑二：試劑質(zhì)量很小，有可能肉眼觀察不到，直接使用即可。臨用前取一支加入0.2mL蒸餾水，-20℃分裝可保存4周，避免反復(fù)凍融。

3. 試劑二工作液：根據(jù)樣本量按試劑二：蒸餾水=0.05mL：0.7mL（約18S）的比例進(jìn)行稀釋，現(xiàn)用現(xiàn)配，使用時置于冰上。

4. 試劑四：臨用前加入20mL提取液一，用不完的試劑分裝后-20℃可保存4周。避免反復(fù)凍融。

5. 試劑五：臨用前加入1.5mL試劑一，用不完的試劑分裝后-20℃可保存4周。避免反復(fù)凍融，使用時置于冰上。

6. 標(biāo)準(zhǔn)品：10μmol/mL谷*酰胺標(biāo)準(zhǔn)液。

產(chǎn)品說明：

谷*酰胺（Glutamine）簡稱Gln，是谷*酸的酰胺，是組成蛋白質(zhì)的重要氨基酸之一。同時谷*酰胺也是三羧酸循環(huán)中α-酮戊二酸的主要來源。谷*酰胺在生物體內(nèi)以游離態(tài)和結(jié)合態(tài)兩種狀態(tài)存在，游離的谷*酰胺是在生物體代謝中起著重要作用，其代謝占細(xì)胞和血液循環(huán)中自由氨基酸的60%以上。

游離谷*酰胺在谷*酰胺酶的催化作用下轉(zhuǎn)變?yōu)楣?酸，谷*酸脫氫酶（GDH）催化谷*酸和NAD生成α-酮戊二酸、NADH和NH₄⁺，在1-mPMS作用下，WST可與NADH反應(yīng)，產(chǎn)生水溶性formazan，其在450nm處有最大吸收峰，據(jù)此可計算谷*酰胺含量。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。 

需自備的儀器和用品：

酶標(biāo)儀/可見分光光度計、低溫離心機、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、可調(diào)式移液器、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、氯仿、96孔板/微量玻璃比色皿、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 組織：按照樣本質(zhì)量（g）：提取液一體積（mL）為1:5~10 的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液一）加入提取液一，冰浴勻漿；12000g 4℃離心5min，取上清加入500µL提取液二，劇烈振蕩5min，12000g 4℃離心5min，取上層液體（呈清澈狀態(tài)）置冰上待測（中層渾濁物質(zhì)和下層液體不需要）。

2. 細(xì)菌或細(xì)胞樣本：收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清，按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個）：提取液一體積（mL）為 500~1000:1 的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液一）加入提取液一，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（溫度4℃，功率200W，超聲 3s，間隔 7s，總時間3min），12000g 4℃離心5min，取上清加入500µL提取液二，劇烈振蕩5min，12000g 4℃離心5min，取上層液體（呈清澈狀態(tài)）置冰上待測（中層渾濁物質(zhì)和下層液體不需要）。

3. 血清（漿）等液體樣本：取500µL樣本加入500µL提取液二（若溶液渾濁則需先離心后取上清），劇烈振蕩5min，12000g 4℃離心5min，取上層液體（呈清澈狀態(tài)）置冰上待測（中層渾濁物質(zhì)和下層液體不需要）。

注：如果需要測蛋白濃度，需在加提取液二之前測定蛋白濃度。

二、測定步驟

1、酶標(biāo)儀/可見分光光度計預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至450nm，可見分光光度計用蒸餾水調(diào)零。

2、0.4μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋：取40μL 10μmol/mL谷*酰胺標(biāo)準(zhǔn)液，加入960μL蒸餾水，充分混勻，配制成0.4μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液使用，現(xiàn)用現(xiàn)配。（實驗中每管需要40μL，為減小實驗誤差，故配制大體積。）

3、在EP管中按下表步驟加樣：

     37℃避光反應(yīng)1h，12000g 常溫離心5min，吸取200μL上清，于450nm處測定吸光值，分別記為A_測定、A_對照、A_{標(biāo)準(zhǔn)}、A_空白。分別計算ΔA_測定=A_測定-A_對照，ΔA_{標(biāo)準(zhǔn)}=A_{標(biāo)準(zhǔn)}-A_空白（標(biāo)準(zhǔn)管和空白管只需做1-2次，每個測定管需設(shè)置一個對照管）。ΔA_測定的測定范圍在0.005-0.7之間。

三、谷*酰胺含量的計算

（1）按樣本蛋白質(zhì)濃度計算（蛋白濃度需自行測定）：

谷*酰胺含量（μmol/mg prot）= ΔA_測定×C_{標(biāo)準(zhǔn)}÷ΔA_{標(biāo)準(zhǔn)}×V樣總÷（Cpr×V樣總）= ΔA_測定×0.4÷ΔA_{標(biāo)準(zhǔn)}÷Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計算：

谷*酰胺含量（μmol/g 質(zhì)量）= ΔA_測定×C_{標(biāo)準(zhǔn)}÷ΔA_{標(biāo)準(zhǔn)}×V樣總÷W=ΔA_測定×0.4÷ΔA_{標(biāo)準(zhǔn)}÷W

（3）按細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量計算：

谷*酰胺含量（μmol/10⁴cell）= ΔA_測定×C_{標(biāo)準(zhǔn)}÷ΔA_{標(biāo)準(zhǔn)}×V樣總÷N= ΔA_測定×0.4÷ΔA_{標(biāo)準(zhǔn)}÷N

（4）按照液體樣本體積計算：

谷*酰胺含量（μmol/mL）= ΔA_測定×C_{標(biāo)準(zhǔn)}÷ΔA_{標(biāo)準(zhǔn)}= ΔA_測定×0.4÷ΔA_{標(biāo)準(zhǔn)}

C_{標(biāo)準(zhǔn)}：標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，0.4μmol/mL；V樣總：加入提取液一之后的樣本體積，1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；N：細(xì)胞數(shù)量，萬個。

注意事項：

1、 如果需要測蛋白濃度，需在加提取液二之前測定蛋白濃度。

2、 如果離心后待測的上清依然渾濁，可嘗試加大離心轉(zhuǎn)速或者延長時間，例如12000g 4℃離心5min。

3、 ΔA測定的測定范圍在0.005-0.7之間。如果測定吸光值超過線性范圍吸光值，可以用蒸餾水稀釋樣本后再次測定，如果測定吸光值小于線性范圍吸光值，需要增加樣本量后再次測定，注意同步計算公式。

實驗實例：

1. 取0.1011g草莓，將樣本進(jìn)行前處理，用蒸餾水稀釋2倍后按照測定步驟操作，96孔板測得計算A_測定 = 0.37，A_對照 = 0.1，?A_測定= 0.27，A_{標(biāo)準(zhǔn)}=0.466，A_空白=0.094，ΔA_{標(biāo)準(zhǔn)}=0.372。按樣本質(zhì)量計算Gln含量得：

谷*酰胺含量（μmol/g 質(zhì)量）=ΔA_測定×0.4÷ΔA_{標(biāo)準(zhǔn)}÷W×2=5.7433μmol/g 質(zhì)量。

2. 取0.1081g兔肌肉，將樣本進(jìn)行前處理，用蒸餾水稀釋2倍后按照測定步驟操作，96孔板測得計算A_測定 = 0.349，A_對照 = 0.147，?A_測定= 0.202，A_{標(biāo)準(zhǔn)}=0.466，A_空白=0.094，ΔA_{標(biāo)準(zhǔn)}=0.372。按樣本質(zhì)量計算Gln含量得：

谷*酰胺含量（μmol/g 質(zhì)量）=ΔA_測定×0.4÷ΔA_{標(biāo)準(zhǔn)}÷W×2=4.0186μmol/g 質(zhì)量。

3. 取0.5mL羊血清，將樣本用蒸餾水稀釋2倍后按照測定步驟操作，96孔板測得計算A_測定 = 0.155，A_對照 = 0.118，?A_測定= 0.037，A_{標(biāo)準(zhǔn)}=0.466，A_空白=0.094，ΔA_{標(biāo)準(zhǔn)}=0.372。按樣本質(zhì)量計算Gln含量得：

谷*酰胺含量（μmol/mL）=ΔA_測定×0.4÷ΔA_{標(biāo)準(zhǔn)}÷W×2=0.0796μmol/mL。

參考文獻(xiàn)：

[1] Tsao M, Otter D E. Quantification of glutamine in proteins and peptides using enzymatic hydrolysis and reverse-phase high-performance liquid chromatography[J]. Analytical Biochemistry, 1999, 269(1):143-148.

[2] Seegmiller J E, Schwartz R, Davidson C S. The plasma ammonia and glutamine content in patients with hepatic coma[J]. Journal of Clinical Investigation, 1954, 33(7), 984.

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