多酚氧化酶（PPO）活性檢測(cè)試劑盒說明書

可見分光光度法
注意：本產(chǎn)品試劑有所變動(dòng)，請(qǐng)注意并嚴(yán)格按照該說明書操作。
貨號(hào)：BC0190
規(guī)格：50T/24S
產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 提取液：臨用前將粉劑一倒入提取液中，溶液為懸濁液，使用前需搖勻。

產(chǎn)品簡介：
PPO主要存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是一種含銅的氧化酶，能使一元酚和二元酚氧化產(chǎn)生醌，從而引起褐化，與果蔬加工、茶葉品質(zhì)和組培等密切相關(guān)。
PPO能夠催化鄰苯二酚產(chǎn)生鄰苯二醌，后者在410nm有特征光吸收。
注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照每500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（功率200W，超聲3秒，間隔10秒，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10分鐘，取上清，置冰上待測(cè)。

2. 稱取約0.1g組織，加入1mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10分鐘，取上清，置冰上待測(cè)。

3. 血清（漿）：直接檢測(cè)。若有渾濁請(qǐng)離心后去上清使用。

二、測(cè)定步驟

1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至410nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 樣本測(cè)定（在EP管中依次加入下列試劑）

37℃(哺乳動(dòng)物)或25℃（其它物種）中準(zhǔn)確水浴10min后，迅速放入沸水中加熱10min。冷卻后，5000g，常溫離心10min，收集上清，410nm處檢測(cè)測(cè)定管和對(duì)照管吸光度，計(jì)算ΔA=A測(cè)定-A對(duì)照。
注意：每個(gè)測(cè)定管需要設(shè)置一個(gè)對(duì)照管，可以在不同對(duì)照管中加入不同樣本的粗酶液，然后集中進(jìn)行5min沸水浴處理。
三、PPO活性計(jì)算
（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：
單位的定義：每分鐘每mg組織蛋白在每mL反應(yīng)體系中使410nm處吸光值變化0.01定義為一個(gè)酶活力單位。
PPO活性（U/mg prot）= ΔA÷0.01×V反總÷（Cpr×V樣）÷T =60×ΔA÷Cpr
（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算：
單位的定義：每分鐘每g組織在每mL反應(yīng)體系中使410nm處吸光值變化0.01定義為一個(gè)酶活力單位。
PPO活性（U/g 質(zhì)量）=ΔA÷0.01×V反總÷（W÷V樣總×V樣）÷T =60×ΔA÷W
（3）按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計(jì)算：
單位的定義：每分鐘每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在每mL反應(yīng)體系中使410nm處吸光值變化0.01定義為一個(gè)酶活力單位。
PPO活性（U/10⁴ cell）= ΔA÷0.01×V反總÷（500÷V樣總×V樣）÷T =0.12×ΔA
V反總：反應(yīng)體系總體積，0.9mL；V樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.15mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量，500萬；T：反應(yīng)時(shí)間，10min。
注意事項(xiàng)：
不同樣本的多酚氧化酶最佳的反應(yīng)溫度略有差別，可在25-37℃之間進(jìn)行調(diào)節(jié)。
相關(guān)發(fā)表文獻(xiàn)：

1. Li B, Ding Y, Tang X, et al. Effect of L-Arginine on Maintaining Storage Quality of the White Button Mushroom (Agaricus bisporus)[J]. Food and Bioprocess Technology, 2019, 12(4): 563-574.

2. B Li,Y Ding, X Tang,et al. MTA1 promotes the invasion and migration of pancreatic cancer cells potentially through the HIF-α/VEGF pathway. Journal of Receptor and Signal Transduction Research. August 2018;(IF2.998)

參考文獻(xiàn)：

1. González, Eva M, De Ancos B , Cano M P . Partial Characterization of Polyphenol Oxidase Activity in Raspberry Fruits[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1999, 47(10):4068-4072.

2. Hong‐Wei Zhou, Feng X . Polyphenol oxidase from yali pear (Pyrus bretschneideri)[J]. Journal of the Science of Food & Agriculture, 1991, 57(3):307-313.

3. Tang W, Newton R J . Increase of polyphenol oxidase and decrease of polyamines correlate with tissue browning in Virginia pine (Pinus virginiana Mill.)[J]. plant science, 2004, 167(3):621-628.

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